Baza moleculară pentru editarea sensibilă la metilare de către Cas9

Potrivit nature.com, nucleaza CRISPR–Cas9 (Cas9) a devenit un instrument puternic pentru manipularea genomului unui spectru larg de organisme. Cu toate acestea, nu a reușit să valorifice pe deplin prezența extinsă a metilării ADN-ului în genomuri. În acest context, raportăm caracterizări biochimice, structurale și de editare a genomului uman ale unei variante de Cas9 sensibilă la metilare (ThermoCas9).

👉 Specificitatea legării și activității ThermoCas9 influențată de metilarea ADN

ThermoCas9 se leagă eficient de ADN și îl taie în aval de motivul adiacent protospacer (PAM) 5′-NNNNCGA-3′ sau 5′-NNNNCCA-3′ în vitro. Totuși, metilarea celei de-a cincea citozine din oricare dintre secvențele PAM (5mCpG sau 5mCpC) inhibă semnificativ activitatea ThermoCas9. Structurile obținute prin microscopie crioelectronică ale ThermoCas9 în stările pre- și post-taie la rezoluții de 2.8 Å și 2.2 Å, respectiv, dezvăluie baza moleculară pentru cerința strictă a citozinei nemetilate în legarea PAM și oferă indicații pentru o mai bună inginerie a enzimelor.

Demonstrarea editării sensibile la metilare de către ThermoCas9 în linii celulare umane cu peisaje distincte de metilare ADN arată, de asemenea, capacitatea sa de a viza eficient genele asociate cu semnătura expresiei luminale, care sunt constant hipometilate la pacienții cu cancer mamar. Având în vedere sensibilitatea sa la metilarea ADN-ului, ThermoCas9 poate viza specific celulele cu hipometilare asociate cu boli, adăugând astfel un alt strat de precizie tehnologiilor de editare a genomului.